人IL-6基因的克隆及其在原核生物中表達及條件的優(yōu)化
構建人白細胞介素6(IL-6)的原核表達載體并優(yōu)化其表達條件,為IL-6的高效表達提供試驗依據(jù).以人T細胞cDNA為模板通過PCR方法擴增IL-6基因,將其克隆到原核表達載體pET28a (+)中,酶切及測序鑒定重組體.將構建好的重組質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3),用IPTG進行誘導表達,產物用Western blotting及人IL-6檢測試劑盒分析鑒定.在保持菌種不改變的前提下,分別改變IPTG的濃度、培養(yǎng)時間、卡那霉素濃度、培養(yǎng)溫度等來優(yōu)化IL-6表達條件.結果顯示,原核表達載體pET28 a(+)-IL-6成功構建,可在大腸桿菌BL21 (DE3)中誘導表達,得到相對分子質量約22 kD的IL-6蛋白,經Western blotting鑒定正確,經人IL-6試劑盒檢測顯示具有較高的免疫活性.在 IPTG濃度400 μmol/mL,卡那霉素濃度50 μg/mL,40℃培養(yǎng)6 h的條件下,目的蛋白表達量最高,可占總蛋白表達量的40%.成功構建人IL-6原核表達載體且獲高效表達,為研究IL-6生物學活性及產品開發(fā)提供了試驗基礎.
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